siRNA干擾檢測

siRNA干擾檢測

原理：RNA干擾 (RNA interference, RNAi)技術(shù)，是將與內(nèi)源mRNA 編碼區(qū)同源的小片段(19 -23bp)外源雙鏈 RNA(siRNA)導(dǎo)入細胞中，引發(fā)細胞中相應(yīng)mRNA 高效特異性降解，從而導(dǎo)致特定基因表達沉默(knock down)的一種實驗技術(shù)，其中通過構(gòu)建表達載體表達siRNA是多種siRNA制備方法中有可能進行長期基因沉默研究的方法，siRNA 載體可以在細胞內(nèi)直接轉(zhuǎn)錄出shrna ，其干擾效果等同于siRNA ，而且能夠解決 siRNA干擾時間短的缺點。您只需提供需干擾基因的詳細信息，包括基因的 mRNA 序列，Genbank Accession No. 和所屬物種，本公司負責(zé)設(shè)計3條針對目的mRNA的siRNA 靶序列，在短時間內(nèi)構(gòu)建三個可用于目的mRNA干擾實驗的siRNA 載體并為您進行后續(xù)的干擾實驗研究。

siRNA干擾檢測實驗流程

◇ 選擇siRNA表達載體 通過人工合成基因的方法將該序列克隆至Clontech公司的RNAi-Ready pSIREN系列表達載體中，該系列表達載體帶有Pol III(U6)啟動子，具有轉(zhuǎn)染效率高、操作簡單、rna沉默效果易于檢測等特點，客戶可根據(jù)需要進行選擇。

◇ 設(shè)計siRNA靶序列

◇ 根據(jù)客戶提交的目的mRNA序列，設(shè)計3條RNA干擾靶序列，靶序列一般為19-21nt 長。

◇ 對于每條選定的siRNA 靶序列，設(shè)計 siRNA 正義鏈和反義鏈，以 loop(9nt or 10nt) 相連，形成穩(wěn)定的發(fā)卡RNA，稱為 shRNA(short hairpin RNA)。

◇ 合成模板 合成每條編碼 shRNA的DNA 模板，并連接到 siRNA 載體相應(yīng)的多克隆位點之間。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。

◇ 抽提陽性克隆質(zhì)粒 公司試劑盒抽提陽性克隆載體并定量。

◇ 轉(zhuǎn)染細胞 質(zhì)粒直接轉(zhuǎn)染或通過病毒包裝后轉(zhuǎn)染細胞，并對轉(zhuǎn)染細胞進行陽性鑒定和轉(zhuǎn)代細胞株的培養(yǎng)。

◇ 干擾效果檢測

◇ 基因水平上檢測 提取RNA、反轉(zhuǎn)錄、Realtime PCR檢測干擾效果(客戶自備細胞系)。

◇ 蛋白水平上檢測 Western Blot檢測蛋白水平干擾效果(客戶自備一抗)。

服務(wù)周期及價格

服務(wù)說明

◇ siRNA服務(wù)需客戶與我們共同討論實驗方案，并提供靶基因名稱、序列或GeneBank ID和希望插入載體的名稱等，免費為您設(shè)計siRNA序列。

◇ 由于構(gòu)建的siRNA表達載體中插入的片段可以形成hairpin結(jié)構(gòu)，因此可能會影響測序。如果我們對質(zhì)粒測序結(jié)果不理想時，將對由質(zhì)粒擴增得到的PCR產(chǎn)物進行測序。